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几种细菌芽孢染色方法的对比分析

来源:原创中版四柱预测彩图网 添加时间:2019-09-04

  摘??? 要: 通过研究几种细菌芽孢染色方法, 对不同方法的优缺点进行比较, 根据实际的实验室条件和诸多因素, 本着方法简易、结果可靠、学生易掌握、成功率高、环保安全等原则, 选出适合教学和科研应用的芽孢染色方法。

  关键词: 芽孢; 染色; 明显; 安全;

  Abstract: By studying several methods of bacterial spore stain and comparing the advantages and disadvantages of different methods, according to the actual laboratory conditions and many factors, on the basis of simple method, reliable results, easy to master, high success rate, environmental protection and security some suitable spore stain methods were selected for teaching and research application.

  Keyword: spore; dyeing; obvious; security;

  芽孢(endospore)是一些革兰氏阳性细菌在生长发育后期形成的休眠保护结构,芽孢的着生位置、形状、大小等因素对细菌有分类学意义[1]。芽孢染色法也是微生物学实验教学和相关科研的一个最基本的实验技术。而芽孢的结构非常复杂,用常规的染色方法很难将其染上颜色。芽孢的染色方法至少有Schaeffer-Fulton法、改良的Schaeffer-Fulton法、Bartholomew-Mittwer法、Moeller法、改良Moeller法、Modified Ziehl-neelsen法、Abbott方法、Doner法及改良Doner法等。初染剂主要有孔雀石绿、石炭酸复红、美蓝。复染剂有沙黄、碱性复红、美蓝等。但每种方法都有一定的优缺点。笔者从事多年微生物学实验教学与研究,对细菌芽孢染色法做了一些改进和探讨,对在实验教学和科研中采用的几种芽孢染色方法的比较和研究进行总结。

  1、 材料和方法

  1.1、 材料

  (1)菌种:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain-114)斜面 (由本课题组分离并保存) ,牛肉膏蛋白胨培养基,37℃培养,48h。

  (2)试剂:5%孔雀石绿,饱和5%孔雀石绿,0.5%沙黄染液,石炭酸复红染液,碱性复红,0.1%吕氏美兰等,冰乙酸等。

  (3)设备:Nikon90i显微镜。

几种细菌芽孢染色方法的对比分析

  1.2、 方法参考[2,3,4,5,6,7,8,9,10]文献,选择并设计以下几种方法。

  方法1:Schaeffer-Fulton法;

  方法2:改良Schaeffer-Fulton法;

  方法3:Schaeffer-Fulton冷染法, 滴加一滴无菌水于洁净载玻片上,挑菌涂布,干燥,经火焰来回20次热固定,饱和的孔雀石绿室温下覆盖染色15min以上,水洗后用0.5%的番红染液染色60S,吸水纸附上吸干多余的番红染液,水洗,干燥后显微镜观察;

  方法4:一滴冰乙酸滴于洁净载玻片上,挑菌涂布,干燥3min,固定,石炭酸复红染液覆盖3min, 水洗,滴加0.1%吕氏美兰染液覆盖2min,水洗,干燥后显微镜观察;

  方法5:一滴无菌水滴于洁净载玻片上,挑菌涂布,干燥,固定,10倍稀释石炭酸复红染液覆盖并微火加热至冒蒸汽,保持5min,注意适时添加染液防干,水洗,滴加0.1%吕氏美蓝染液覆盖2min, 水洗,干燥后显微镜观察;

  方法6:一滴无菌水滴于洁净载玻片上,挑菌涂布,干燥,经火焰来回20次热固定,饱和孔雀石绿覆盖至少15min,水洗,石炭酸复红染液覆盖2min, 水洗,干燥后显微镜观察。

  图 (1-6) 不同方法芽孢染色观察图片 (1000倍放大)
图 (1-6) 不同方法芽孢染色观察图片 (1000倍放大)

  2 、结果

  六种染色方法结果见图(1-6),实验结果显示:用不同Schaeffer-Fulton法的芽孢染色 (图1、2、3) 结果中菌体颜色偏橙红,与芽孢的绿色对比效果比较明显,结果容易观察,不管是加热载玻片 (图1) 或者沸水浴法 (图2) 等加热方法,还是室温冷染法 (图3) ,都可以达到较好的效果;图4、5为石碳酸复红初染剂美蓝为复染剂的结果,实验结果显示,红和蓝色的对比不明显,难以轻松区分芽孢和菌体细胞,而且乙酸干燥时非常快,需要添加2-3次,不好把握和操作。而且石碳酸具有明显挥发性,对人体皮肤、黏膜具有明显刺激,在使用石碳酸加温促染时会感觉到眼睛和鼻部的不适。图6为方法6的结果,将复染剂沙黄改为石碳酸复红,菌体染色淡紫红色,与芽孢的绿色对比明显,效果较好,且感官漂亮。

  3、 讨论

  (1)对于本文所述的方法1、2、3三种方法中,冷染法染色效果不次于前两种加热法,而且对学生在实验室操作有诸多好处:首先冷染不会产生蒸汽,而加热方法均无法减少因操作中加热带来的染料挥发而产生的孔雀石绿热蒸汽,孔雀石绿具有高毒、高残留、致癌、致畸等作用,会造成环境的污染和危害实验中的学生和老师的健康;同时由于加热或沸水浴产生的蒸汽使实验室环境潮湿,影响实验过程中放置在实验台上的显微镜,容易造成显微镜镜头长霉,难以保养修复,影响观察并降低了显微镜的使用寿命;同样不用加热的方法也减少酒精灯或电炉等的使用,利于节能和环保,也有利于实验室安全。

  对于方法4和5,实验结果显示,红蓝的对比没有红绿的对比明显,并且笔者也曾尝试了不同的试剂浓度和染色时间的比较,难以得到明显的结果,方法4中虽然避免了加热对染色剂的挥发,但用乙酸替代水,涂片干燥时非常快,需要添加2-3次,不好把握和操作。石炭酸对人体皮肤、黏膜具有明显刺激作用,方法5中由于需要对石碳酸复红染液加热,加温促染促进了石碳酸的挥发,操作者会感觉到眼睛和鼻部的不适。由于结果对比不明显以及染液的不安全性,所以实验教学中不建议采用方法4和5。

  方法6将复染剂沙黄改为石碳酸复红,并且采用冷染法,菌体淡紫红色,与芽孢的绿色对比明显,效果较好,感官漂亮,而且没有加温促染导致的大量有毒蒸汽。

  (2)我校微生物实验课面向生物工程、食品科学与工程、生物技术、水产养殖、药物制剂、海洋科学等9个专业,以往用Schaeffer-Fulton法的芽孢染色实验课结束,不仅酒精灯、实验台等沾上很多染料,实验室里也产生了很多的孔雀石绿有毒蒸汽或水蒸汽。

  所以,综合考虑,我们目前采用的教学方法是方法3和方法6,并且将芽孢染色观察实验和革兰氏染色观察两个实验项目安排在一个下午完成,引导学生先完成芽孢杆菌革兰氏染色后留意观察少数形成的无色芽孢,然后再观察用方法3或方法6完成的芽孢染色涂片,取得了较好的实验效果,由于这两种芽孢染色方法都是冷染法,需要初染的时间比较长一些,同学们在芽孢初染等待的时间去完成革兰氏染色实验和观察,这样统筹利用时间,提高课堂的效率。实践显示,这两种方法简便易行、有效、结果明显,更适于在实验教学中应用,并且也比较环保和安全。

  参考文献

  [1]周德庆.微生物学教程[M].北京:高等教育出版社, 2010:25.
  [2]沈萍, 范秀荣, 李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社, 2007:76.
  [3]陈金春, 陈国强.微生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社, 2005:72.
  [4]赵斌, 何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社, 2002:42-43.
  [5]杨革.微生物学实验教程[M].北京:科学出版社, 2004:22-23.
  [6]唐丽杰.微生物学实验[M].哈尔滨:哈尔滨工业大学出版社, 2005:41.
  [7]郑冬超, 王甜, 李媛媛, 等.细菌芽孢染色法的改良探索[J].实验科学与技术, 2014, 12 (5) :23-24.
  [8]陈豪, 郭佳媛, 刘美杉, 等.枯草芽胞杆菌染色方法的探讨[J].基础医学研究, 2017, 31 (11) :131-132.
  [9]郑冬超, 樊佳, 王雨昊, 等.浸染法改良细菌芽胞染色实验的探索[J].实验技术与管理, 2015, 32 (7) :191-192.
  [10].James W.Bartholomew, Tod Mittwer.A Simplified Bacterial Spore Stain[J].Stain technology, 1950, 25 (3) :153-156 (Published online:12 July, 2009) .

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